Análise Bacteriológica de Águas. Pesquisa, confirmação e determinação do número de bactérias coliformes



Objectivos

Pesquisar, confirmar e determinar o número de coliformes totais e fecais em 100 ml de uma amostra de água.

Informação

Os coliformes totais são bactérias de morfologia bacilar, Gram negativas, aeróbias ou anaeróbias facultativas, oxidase negativa, não esporoladas, que fermentam a lactose com produção de ácido e gás a 37°C em um tempo máximo de 48 horas. O grupo compreende os géneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter, pertencentes à família das Enterobactereaceae.

Os coliformes fecais são bactérias coliformes de origem fecal, compreendidas no grupo anterior e capazes de fermentar a lactose com produção de ácido e gás a 44 °C.

O volume de amostra a analisar é de 100 ml para os coliformes totais e coliformes fecais. O métodos utilizado consiste em filtrar a amostra, com uma membrana estéril de porosidade 0,45 µm (GN-6 Metricel Grid 47 mm 0,45 µm S-Pack). Essa filtração só é possível utilizando um sistema apropriado, que consiste numa base de apoio ao filtro com adaptação ao kitazato e um copo onde é colocada a amostra, estas duas peças são unidas por uma tenaz.

Material

  • Amostra de água
  • Álcool
  • Proveta de 100 ml estéril
  • Caixas de Petri estéreis
  • Balança
  • Matrazes
  • Placa de aquecimento e agitação
  • Autoclave ou panela de pressão
  • Papel de limpeza
  • Banho termóstato
  • Meios de cultura desidratados - MLSA (Membrane Lauril Sulfate Agar), MFCA (Membrane Faecal Coliforms Agar), BRILA (Brilliant-green Bile Lactose Broth) e Água de Peptona
  • Espátula
  • Proveta graduada 250 ml
  • Estufas de incubação
  • Contador de colónias
  • Caneta de acetato
  • Frascos de esterilização
  • Bico de Bunsen ou lamparina de álcool
  • Sistema de filtração
  • Membranas filtração 0,45 µm
  • Pinças
  • Bomba de vácuo
  • Reagente de Kovacs

Preparação dos meios de cultura

Meio de MLSA (Membrane Lauril Sulfate Agar)

Para o volume de meio pretendido, pesar para um matraz a massa de meio desidratado segundo as especificações do fabricante.

Adicionar ao matraz o volume de água destilada, correspondente à massa de meio pesada.

Com agitação levar o meio à fervura na placa de aquecimento, até que todos os ingredientes do meio se dissolvam.

Verter o meio para o frasco de esterilização e levar ao autoclave à temperatura de 121ºC durante 20 min.

Após esterilização arrefecer  meio a 50ºC no banho termóstato.

Distribuir o meio por caixas de Petri estéreis. Adicionar a cada caixa cerca de 20 mL do meio e deixar solidificar à temperatura ambiente.

Meio de MFCA (Membrane Faecal Coliforms Agar)

Para o volume de meio pretendido, pesar para um matraz a massa de meio desidratado segundo as especificações do fabricante.

Adicionar ao matraz o volume de água destilada, correspondente à massa de meio pesada.

Com agitação levar o meio à fervura na placa de aquecimento, até que todos os ingredientes do meio se dissolvam.

Deixar ferver durante 1 min. Este meio não pode ser autoclavado, o calor altera as suas propriedades.

Arrefecer  meio a 50ºC no banho termóstato.

Distribuir o meio por caixas de Petri estéreis. Adicionar a cada caixa cerca de 20 mL do meio e deixar solidificar à temperatura ambiente.

Meio de BRILA (Brilliant-green Bile Lactose Broth)

Para o volume de meio pretendido, pesar para um matraz a massa de meio desidratado segundo as especificações do fabricante.

Adicionar ao matraz o volume de água destilada, correspondente à massa de meio pesada.

Com agitação dissolver todos os ingredientes do meio.

Distribuir o meio por tubos de ensaio medindo 10 ml para cada.

Colocar dentro de cada tubo de ensaio já com o meio de cultura um tubo de fermentação, (tubo de vidro com as dimensões aproximadas de 30x3 mm), invertido.

Levar os tubos ao autoclave à temperatura de 121ºC durante 20 min.

Meio de água peptona

Para o volume de meio pretendido, pesar para um matraz a massa de meio desidratado segundo as especificações do fabricante.

Adicionar ao matraz o volume de água destilada, correspondente à massa de meio pesada.

Com agitação dissolver todos os ingredientes do meio.

Distribuir o meio por tubos de ensaio medindo 10 ml para cada.

Levar os tubos ao autoclave à temperatura de 121ºC durante 20 min.

Procedimento experimental

Determinação do n° de bactérias coliformes totais

1- Os elementos do sistema de filtração que vão entrar em contacto com a água a analisar devem estar estéreis. A esterilização faz-se em autoclave ou por lavagem com álcool, queimando de seguida o álcool residual.

2- Adaptar o sistema de filtração ao kitazato. Colocar uma membrana filtrante de porosidade 0.45 µm estéril sobre o suporte de filtração, utilizando pinças estéreis (lavagem com álcool, queimando de seguida o álcool residual).

3- Com uma proveta estéril medir 100 mL da amostra de água e filtrar recorrendo ao vácuo.

4- Desmontar o sistema de filtração. e utilizando pinças estéreis transferir a membrana filtrante para placa de Petri contendo meio de Membrane Lauril Sulfate Agar de modo que a superfície de filtração fique para cima. Fechar a placa e incubar invertida a 37°C durante 24 horas.

5- A leitura dos resultados requer um exame das colónias que aparecem sobre a membrana e na superfície do Agar circundante. São consideradas colónias suspeitas de coliformes totais, aquelas que apresentarem cor característica da zona ácida do indicador de pH adicionado ao meio.

6- Para confirmação das colónias suspeitas, repicar assépticamente cada colónia para tubo contendo Caldo de BRILA e incubar a 37°C durante 24 horas.

7- São considerados positivos os tubos que apresentarem turvação e gás no tubo de fermentação.

8- Calcular o n° de bactérias coliformes totais em 100 mL de água.

Determinação do n° de bactérias coliformes fecais e de E. coli

9- Fazer a filtração de 100 ml água analisar utilizando o método descrito anteriormente.

10- Colocar a membrana em placa de Petri contendo meio de MFC Agar. Incubar a 44°C durante 24 horas.

11- Após incubação contar as colónias suspeitas de coliformes fecais (colónias de cor azul). Para confirmação das colónias suspeitas, repicar assépticamente cada colónia para  um tubo contendo caldo de BRILA e outro tubo com água peptona e incubar a 44°C durante 24 horas.

12- São considerados positivos os tubos de caldo de BRILA com turvação e gás no tubo de fermentação.

13- Aos tubos de água de peptona que apresentarem turvação adicionar reagente de Kovacs, o aparecimento de um anel vermelho permite concluir a presença de E. coli (lndol + )

14- Calcular o n° de bactérias coliformes totais e de E. coli em 100 mL de água.